3.4 단백질의 1차 구조

아미노산 20종의 종류와 개수가 같더라도 연결 순서가 달라지면 단백질의 성질은 달라질 수 있다. DNA 서열에 저장된 정보가 폴리펩타이드의 아미노산 순서를 결정하고, 그 순서는 단백질 접힘과 생물학적 기능을 제약한다. 그러나 실제 생체 내 단백질에는 절단과 번역 후 변형, 환경과 결합 상대의 영향이 추가된다. 따라서 “서열을 알면 모든 기능을 즉시 알 수 있다”는 설명은 지나친 단순화이다.

1. 단백질 1차 구조의 정의와 서열 표기

단백질의 1차 구조(primary structure)는 폴리펩타이드 사슬을 이루는 아미노산 잔기의 공유결합적 연결 순서를 뜻한다. 일반적으로 사슬의 자유 아미노 말단(N-말단)에서 카르복실 말단(C-말단) 방향으로 표기한다. 3문자 약호(예: Ala–Gly–Ser)와 1문자 약호(AGS)를 모두 사용할 수 있다. 이황화결합처럼 사슬 사이 또는 사슬 내부의 공유결합은 별도로 주석으로 나타내기도 한다.

2. 서열 변화는 구조·기능에 다양한 영향을 준다

아미노산 치환은 단백질 표면의 전하, 소수성, 입체적 부피, 수소결합 가능성에 영향을 줄 수 있다. 어떤 치환은 거의 영향을 주지 않지만, 활성 부위·결합 부위·분자 내부의 핵심 위치에서 일어난 치환은 기능을 크게 변화시킬 수 있다. 보존적 치환이라 해도 기능적 영향이 없다고 단정할 수 없으며, 반대로 비보존적 치환도 특정 환경에서는 영향이 작을 수 있다.

대표적인 분자 질환인 낫모양적혈구병에서는 β-글로빈의 글루탐산이 발린으로 치환된다. 관습적으로 성숙 β-사슬을 기준으로 Glu6Val이라 부르며, 개시 메티오닌을 포함한 번역 산물 기준으로는 Glu7Val로 기록한다. 치환으로 인해 탈산소 상태에서 비정상적인 단백질 간 상호작용이 증가하여 헤모글로빈 S가 중합될 수 있다.

1. 서열을 직접 측정하는 방법과 유전자로부터 예측하는 방법

단백질 서열은 고전적 화학 분석과 질량분석으로 직접 조사할 수 있다. 또한 DNA 서열을 전사·번역 과정에 따라 해독하여 폴리펩타이드의 예상 서열을 얻을 수 있다. 그러나 실제 시료에는 스플라이싱에 따른 아이소폼, 개시 메티오닌 제거, 신호펩타이드 절단, 단백질분해 가공, 인산화·당화 등 번역 후 변형이 존재할 수 있으므로, 유전자 서열만으로 성숙 단백질의 모든 상태를 확정할 수는 없다.

2. 단백질 서열 데이터베이스와 FASTA 형식

UniProtKB와 같은 데이터베이스는 단백질 서열뿐 아니라 생물종, 기능, 세포 내 위치, 변이, 변형과 근거 문헌을 함께 제공한다. FASTA 형식은 >로 시작하는 설명 행 다음에 한 문자 서열을 배치한다. 데이터베이스에서 정보를 사용할 때에는 접근번호(accession), 아이소폼, 데이터 갱신일, 주석의 근거 유형을 함께 확인해야 한다.

1. N-말단 판독: 에드만 분해

에드만 분해(Edman degradation)에서는 자유로운 N-말단 아미노기를 페닐아이소티오시아네이트(PITC)로 유도체화한 후 첫 번째 잔기를 선택적으로 절단한다. 생성된 PTH-아미노산을 크로마토그래피로 확인하고, 짧아진 사슬에 같은 과정을 반복하여 잔기를 순서대로 읽는다. 반응 수율이 반복할 때마다 누적해서 감소하기 때문에 긴 단백질을 한 번에 읽기는 어렵다. 또한 N-말단이 화학적으로 막혀 있는 단백질에는 별도 처리가 필요할 수 있다.

예를 들어 순환당 판독 가능 비율이 98%라면 30회 이후에도 올바른 신호를 유지하는 모형 비율은 0.98³⁰ ≈ 0.545이다. 이 계산은 각 단계가 독립적이며 모든 단계의 효율이 동일하다는 단순 모형을 전제로 한다.

2. 특정 위치 절단과 중첩 펩타이드

단백질이 길면 트립신(trypsin) 등의 단백질분해효소로 잘라 작은 절편을 만든다. 트립신은 일반적으로 라이신(K) 또는 아르기닌(R) 뒤의 펩타이드 결합을 절단하지만, 다음 잔기가 프롤린(P)인 경우 절단이 제한될 수 있다. 시아노젠 브로마이드(CNBr)는 메티오닌(M) 잔기 뒤를 절단하는 고전적 화학 시약이다. 서로 다른 절단 방식으로 얻은 펩타이드들의 중첩 서열을 비교하면 원래 사슬의 연결 순서를 재구성할 수 있다.

중첩 절편의 결합 순서를 정할 때는 절단 지점이 빠짐없이 검출되었는지, 동일한 짧은 서열이 반복되는지, 시료 내 다른 단백질의 절편과 혼합되었는지를 검토해야 한다. 고전적 중첩 절편 분석은 오늘날에도 질량분석 결과 검증의 기본 사고방식과 연결된다.

1. 질량분석의 측정량과 분석 흐름

질량분석법(MS)은 이온의 질량 대 전하비(m/z)를 측정한다. 단백질 분석에서는 보통 효소로 절단한 펩타이드를 액체크로마토그래피(LC)로 분리한 뒤 이온화하고, 특정 전구체 이온(precursor ion)을 선택해 단편화하여 생성 이온(product ion)의 스펙트럼을 기록한다. 단편 패턴을 계산된 이론 스펙트럼 및 데이터베이스 서열과 비교하면 펩타이드를 동정하거나 서열을 추론할 수 있다.

m/z는 질량과 같지 않다. 질량이 같은 분자라도 전하수가 다르면 관측 위치가 달라진다. 예를 들어 중성 펩타이드 질량 M에 양성자 두 개가 붙은 2가 양이온은 약 (M + 2mH⁺)/2의 m/z를 갖는다. 단일동위원소 질량 계산에서는 원소·잔기별 정확한 질량을 사용한다.

2. b 이온과 y 이온으로 펩타이드 방향 읽기

충돌 유도 단편화에서는 펩타이드 결합 주변의 절단으로 b 이온(N-말단을 포함하는 단편)과 y 이온(C-말단을 포함하는 단편)이 관찰될 수 있다. 연속된 b 이온 사이의 질량 차이는 새로 더해진 아미노산 잔기의 질량에 대응하며, y 이온에서도 같은 방식으로 C-말단 쪽 잔기를 해석한다. 다만 실제 스펙트럼에는 다른 이온 유형, 중성 손실, 동위원소 피크, 여러 전하 상태가 함께 나타날 수 있다.

계산 예: AGS의 중성 단일동위원소 질량은 71.03711 + 57.02146 + 87.03203 + 18.01056 = 233.10116 Da이다. 단일 양성자화 이온 [M+H]⁺는 약 234.10844 m/z가 된다. b₁(A)는 72.04439, b₂(AG)는 129.06585, y₁(S)는 106.04987, y₂(GS)는 163.07133 m/z이다(표기 수치는 반올림에 따라 마지막 자리 차이가 날 수 있다).

3. 질량분석의 강점과 한계

질량분석법은 고감도로 많은 펩타이드를 동시에 분석할 수 있고, 산화·인산화 같은 변형 가능성을 탐지하는 데 유용하다. 그러나 같은 질량을 갖는 류신과 아이소류신은 통상적인 질량 차이만으로 구분하기 어렵다. 또한 스펙트럼이 불완전한 경우 여러 후보 서열이 같은 결과에 부합할 수 있으므로 단백질 수준 동정, 표적·교차 검증, 거짓발견율(FDR) 등 분석의 신뢰도를 함께 고려해야 한다.

1. 고체상 펩타이드 합성(SPPS)

메리필드가 개발한 고체상 펩타이드 합성(SPPS)은 불용성 수지에 C-말단 아미노산을 고정한 뒤 아미노기 보호를 해제하고 다음 아미노산을 결합시키는 과정을 반복한다. 현재 널리 쓰이는 Fmoc 전략에서는 보호기 제거와 결합 반응을 반복한 후 수지에서 생성물을 분리한다. 생체 내 리보솜에서는 N→C 방향으로 폴리펩타이드가 연장되지만, 전형적인 SPPS에서는 C→N 방향으로 사슬을 연장한다.

2. 반복 수율의 누적 효과

모든 단계가 독립적이고 단계 수율이 일정하다고 가정하면, n번의 결합·탈보호 순환에서 완전길이 산물이 남는 이론적 비율은 Y = qⁿ으로 근사할 수 있다. 예를 들어 q = 0.99, n = 30이라면 Y = 0.99³⁰ ≈ 0.740이다. 실제 수율은 측쇄 반응, 불완전 결합, 제거·정제 과정, 각 단계의 조건 차이 등에 따라 달라진다.

화학적으로 합성한 펩타이드는 연구용 효소 기질, 수용체 결합 탐침, 항원 조각 및 후보 의약품 개발에 이용된다. 단, 사슬이 길어질수록 불완전 서열을 제거하기 어려워지고, 복잡한 다중 이황화결합 형성과 변형을 재현하는 과정이 추가될 수 있다.

1. 서열에서 추정할 수 있는 성질

아미노산 조성으로 단백질의 대략적인 분자량·등전점·소수성 경향을 추정할 수 있다. 또한 특정 서열 패턴은 막 통과 영역, 핵 이동 신호, 효소 활성 부위 후보, 인산화 모티프 등의 단서를 제공한다. 그러나 서열의 일부분만으로 효소의 실제 촉매 기능을 확정할 수 없고, 예측된 모티프가 생체에서 사용되는지는 실험으로 검증해야 한다.

2. 서열 정보와 실험의 결합

연구자는 알려진 서열과 비교해 새로운 단백질의 기능을 추정한 뒤, 표적 잔기의 치환, 활성 측정, 결합 실험, 질량분석, 구조 분석 등으로 가설을 검증한다. 반복적으로 나타나는 모티프는 연구 우선순위를 정하는 데 유용하지만 “서열 일치 = 기능 동일”이라는 등식은 성립하지 않는다.

앞에서 제시한 서열·접힘·기능의 관계도를 다시 참고하고, 서로 다른 서열이 구조에 미치는 영향을 예측한 뒤 실험 설계를 제안한다.

1. 서열 정렬과 진화적 보존

서열 정렬(sequence alignment)은 서로 다른 생물의 단백질에서 대응하는 잔기 위치를 추정하는 과정이다. 전체 서열을 맞추는 전역 정렬(global alignment)과 유사한 구간을 찾는 지역 정렬(local alignment)은 목적이 다르다. 동일한 잔기의 비율(identity)과 화학적 성질이 유사한 치환까지 고려한 유사도(similarity)는 구분해야 한다. 상동성(homology)은 공통 조상에서 유래했다는 진화적 관계를 뜻하므로 “상동성 75%”라는 표현보다는 “서열 동일성 75%”처럼 측정값을 명확히 표기한다.

보존된 위치는 구조 또는 기능에 중요할 가능성이 있지만, 공통 조상 때문에 보존되는 중립적 특징도 있을 수 있다. 유전자 중복으로 생긴 패럴로그(paralog)와 종 분화로 갈라진 오솔로그(ortholog)는 서로 다른 관계이므로 서열 유사성이 높다는 사실만으로 역할이 같다고 단정할 수 없다.

2. 단백질 계통수의 해석

여러 종의 상동 단백질 서열을 정렬하고 치환 모형을 적용해 유전자 계통수를 추정할 수 있다. 그러나 계통수의 가지 길이는 사용한 방법에 따라 변화량 또는 시간과 관련되며, 유전자 계통수와 종 계통수가 언제나 일치하는 것은 아니다. 분석에는 서열 길이, 정렬 품질, 채택한 치환 모형, 참조 종, 표본 수 등이 영향을 준다.

공통 서열(consensus sequence)은 여러 서열을 정렬한 뒤 각 위치에서 가장 자주 등장하는 아미노산으로 요약한 것이다. 그러나 서로 다른 잔기가 어느 비율로 나타나는지, 해당 위치가 얼마나 보존되어 있는지는 공통 서열만으로 충분히 드러나지 않는다. 이를 보완하는 시각화가 서열 로고(sequence logo)이다.

표준적인 정보량 기반 서열 로고에서 한 열의 전체 높이는 위치별 정보량 R = log₂20 − H로 나타낼 수 있고, H = −Σ p(a) log₂ p(a)는 샤논 엔트로피이다. 한 위치에서 잔기 a의 문자 높이는 일반적으로 p(a)R에 비례한다. 여기서 p(a)는 해당 위치에서 잔기 a가 관찰된 비율이다. 표본 수가 작으면 정보량의 편향을 보정하는 방법을 추가로 고려한다.