3.3 단백질의 연구

세포 추출액에는 수많은 단백질이 함께 존재한다. 특정 효소의 기능을 확인하려면 표적 효소를 혼합물에서 구별해야 하며, 단백질이 얼마나 들어 있는지도 알아야 한다. 단백질 분리·정제는 구성 성분의 차이를 활용하는 과정이고, 단백질 분석은 얻은 분획의 정체·양·활성·순도를 검증하는 과정이다. 두 과정은 서로 떨어져 있지 않으며 반복적으로 연결된다.

이번 단원은 3.1에서 배운 pKa·등전점과 3.2에서 배운 펩타이드의 전하·질량을 실제 분석법으로 확장한다. 단백질을 단지 “하나의 밴드”로 확인했다고 해서 곧바로 완전한 순도와 기능이 증명되는 것은 아니라는 점을 처음부터 염두에 두어야 한다.

1. 분리와 정제의 목적

분리(separation)는 혼합물에 존재하는 성분을 서로 다른 분획으로 나누는 것이다. 정제(purification)는 그중 표적 단백질의 상대적 비율 또는 표적에 대한 특이적 활성을 높이는 방향으로 분리를 이어 가는 과정이다. 일반적으로 세포 추출, 초기 분획, 여러 종류의 크로마토그래피, 검출과 평가 순으로 진행한다. 표적 단백질이 불안정하거나 막에 결합해 있으면 별도의 추출·보존 조건이 필요하다.

2. 표적 단백질의 활성을 보존하는 추출

단백질은 온도, pH, 염 농도, 산화 상태와 단백질분해효소에 민감할 수 있다. 따라서 효소 기능을 유지하려면 일반적으로 적합한 완충액을 사용하고 가능한 한 낮은 온도에서 신속히 작업한다. 원심분리로 세포 잔해나 불용성 부분을 제거해 가용성 단백질을 포함한 상등액을 얻는다. 다만 막단백질이나 불용성 단백질은 침전물 쪽에 남을 수 있으므로 목표 단백질의 존재 위치를 확인해야 한다.

3. 염석과 투석은 물에 대한 친화도 차이를 활용한다

단백질 용해도는 표면 전하와 단백질-물 상호작용에 의존한다. 황산암모늄 등의 염을 높은 농도로 첨가하면 염 이온이 물과 상호작용하여 일부 단백질의 용해도가 감소하고 침전이 형성될 수 있다. 염 농도를 단계적으로 조절하면 서로 다른 단백질을 분획할 수 있다. 이러한 염석(salting out)은 거친 분리 단계이므로 침전 분획을 다시 녹여 필요하면 투석이나 탈염으로 작은 이온을 제거한다.

투석막의 분리 기준은 막을 통과할 수 있는 입자의 크기이며 단백질의 이름이 아니다. 작은 염 이온은 외부 용액으로 확산하고 큰 단백질은 상대적으로 남는다. 투석을 통해 모든 염이 즉시 제거되는 것은 아니고 농도 구배와 시간·외액 교환 횟수에 따라 제거 정도가 달라진다.

4. 크로마토그래피는 물리·화학적 특성 차이를 이용한다

크로마토그래피에서는 이동상과 고정상 사이의 상호작용 차이로 단백질의 용출 시간이 달라진다. 표적의 전하, 수화 반지름, 소수성 표면 또는 특정 리간드와의 결합 여부에 따라 적절한 고정상을 고른다. 한 종류의 방법으로 원하는 순도를 얻기 어려우므로 여러 분리 원리를 조합할 수 있다.

5. 이온교환 크로마토그래피

양이온 교환(cation exchange) 수지는 보통 음전하를 띠며 양전하 단백질을 붙잡는다. 반대로 음이온 교환(anion exchange) 수지는 양전하를 띠며 음전하 단백질과 결합한다. 단백질의 표면 전하는 pH에 따라 바뀌므로, pH가 등전점보다 낮으면 일반적으로 더 양전하를 띠며 반대 조건에서는 더 음전하를 띤다. 하지만 표면의 국소 전하 분포가 중요하므로 pH와 pI의 비교만으로 결합 강도를 정확하게 예측할 수는 없다.

6. 크기배제 크로마토그래피와 친화 크로마토그래피

크기배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography, SEC)에서는 작은 분자가 고정상의 기공 내부를 드나들어 평균 이동 경로가 길어지고, 큰 분자는 기공에 접근하기 어려워 비교적 일찍 용출된다. 단백질의 실제 분자량보다 수화 반지름·분자 모양이 용출에 직접 영향을 주며, 큰 응집체가 먼저 나올 수도 있다.

친화 크로마토그래피(affinity chromatography)는 효소와 리간드, 항체와 항원, 히스티딘 태그와 고정화 금속 이온 등의 특이적 상호작용을 활용한다. 비결합 성분을 세척한 뒤 조건을 바꾸거나 경쟁 리간드를 이용해 표적을 회수한다. 친화성은 순도 향상에 유리하지만, 결합이 강하더라도 표적 단백질이 전혀 변성되지 않는다고 보장할 수는 없다.

7. 크로마토그램과 분획 회수

크로마토그램은 용출 부피 또는 시간을 가로축으로, 검출 신호를 세로축으로 나타낸 그래프이다. 280 nm 흡광도 피크는 방향족 잔기를 포함한 단백질의 존재를 나타낼 수 있지만 표적만을 선택적으로 가리키지는 않는다. 표적 효소의 활성 또는 별도 검출법을 이용하여 관심 피크가 어떤 분획인지 확인해야 한다. 여러 피크가 겹치면 분리 조건을 다시 조정하거나 추가 정제를 계획한다.

8. 정제의 성공은 총단백질량과 표적 활성을 함께 계산한다

효소를 표적으로 정제할 때 총활성(total activity)은 회수된 모든 분획에 포함된 표적 효소 반응 능력이고, 비활성(specific activity)은 총단백질 1 mg당 효소 활성이다. 정제배수는 처음 시료의 비활성과 비교하여 얼마나 높아졌는지, 수율은 처음 총활성 가운데 얼마나 회수했는지를 뜻한다. 비활성 증가와 총활성 손실은 동시에 일어날 수 있다. 따라서 “정제배수가 크다”는 사실만으로 좋은 공정이라고 결론짓기는 어렵다.

다음 표는 효소 정제 과정을 연습하기 위해 구성한 모의 데이터이다. 각 단계의 전체 단백질량과 효소 총활성을 직접 측정했다고 가정한다. 표적 활성이 측정 가능한 안정된 효소라는 조건에서만 이러한 정제 평가법이 가능하다.

이 계산에서 높은 비활성은 대체로 표적 효소가 농축되었음을 시사하지만 최종 순도를 60%라고 뜻하지는 않는다. 비효소성 단백질, 효소의 활성을 바꾸는 억제제, 측정 조건의 변화를 고려해야 하며, 정제 완료 여부는 전기영동·분석 크로마토그래피 같은 독립 검증법으로 확인한다.

1. 단백질의 전기영동 이동은 무엇으로 결정되는가?

전기영동(electrophoresis)은 전기장 아래에서 대전된 분자가 이동하는 현상을 이용한다. 단백질은 이온화 가능한 말단과 곁사슬 때문에 pH에 따라 전하가 달라진다. 실제 이동 속도는 순전하뿐 아니라 분자 모양, 크기, 겔의 기공, 완충액의 이온강도, 전압, 온도에 영향을 받는다. 따라서 분석 목적에 따라 단백질의 구조를 유지할지 변성시킬지를 먼저 결정해야 한다.

2. SDS-PAGE는 주로 폴리펩타이드 크기를 비교한다

SDS는 음이온 계면활성제로 단백질의 비공유결합성 구조를 풀고 폴리펩타이드 사슬에 결합한다. 이렇게 처리한 단백질은 대체로 비슷한 음전하/질량 비율을 나타내어 폴리아크릴아마이드 겔에서 크기에 따라 분리된다. 환원제 DTT 또는 2-메르캅토에탄올을 함께 넣으면 이황화결합을 끊어 서로 연결된 사슬을 나눌 수 있다. 다만 단백질의 구조, 변형, 막단백질 특성에 따라 이동도가 예외적으로 달라지므로 측정값을 겉보기 분자량이라고 부른다.

전기영동 겔에서 크기가 큰 분자는 작은 분자보다 기공을 통과할 때 더 큰 저항을 받아 일반적으로 덜 이동한다. 같은 겔에서 여러 단백질의 이동거리를 분자량 표준 단백질과 비교하면 겉보기 분자량을 추정할 수 있다. 밴드 수가 줄어드는 모습은 정제 추세를 보여 주지만 한 밴드만 보인다고 해서 불순물이 전혀 없다는 의미는 아니다.

3. 표준곡선으로 단백질의 겉보기 분자량을 추정한다

상대 이동도 Rf는 시료의 이동 거리와 염료 전선(dye front)의 이동 거리의 비이다. 흔히 겔의 선택된 분리 범위에서 log₁₀(분자량)과 Rf가 근사적인 직선 관계를 갖는다. 표준 단백질의 이동도·분자량을 기록하고 직선에 보간하여 미지 밴드의 분자량을 추정한다. 표준곡선 범위를 크게 벗어나 외삽하면 오차가 커질 수 있다.

4. Native PAGE·등전점 전기영동·2차원 전기영동

Native PAGE는 SDS 등 강한 변성제를 사용하지 않아 단백질의 접힘 상태와 일부 복합체를 유지할 수 있다. 이때 이동 속도는 분자량만으로 결정되지 않고 전하와 모양까지 영향을 준다. 따라서 일반적인 Native PAGE의 이동 거리만으로 분자량을 정확히 결정해서는 안 된다. 반면 SDS-PAGE는 변성된 사슬의 크기 분리에 유리하다.

등전점 전기영동(isoelectric focusing, IEF)에서는 pH 구배 속에서 단백질이 자신과 같은 pI 부근에 모인다. 2차원 전기영동(2D PAGE)은 첫 번째 축에서 pI로, 두 번째 축에서 SDS-PAGE로 겉보기 분자량에 따라 분리한다. 다양한 단백질을 혼합한 시료에서 서로 다른 분리 기준을 이용하므로 여러 단백질을 점 형태로 구분할 수 있다.

5. 밴드의 동일성은 분리만으로 증명되지 않는다

동일한 분자량의 서로 다른 단백질이 한 밴드 위치에 겹칠 수 있으며, 같은 단백질도 절단·변형·응집으로 여러 밴드에 나타날 수 있다. 표적 단백질을 확인하려면 항체에 의한 Western blot이나 질량분석처럼 추가적인 표적 식별 방법을 사용한다. 밴드의 진하기는 단백질의 양과 대체로 관련되지만 시약의 염색 반응, 검출기의 포화, 단백질별 염색 감도에 따라 신호가 달라지므로 엄밀한 정량에는 검증된 표준과 선형 범위가 필요하다.

1. 정량화할 대상부터 명확히 정의한다

혼합 시료를 정제하지 않아도 총단백질 농도를 측정할 수 있다. 그러나 이 값은 시료 안에 있는 특정 단백질의 농도와 같지 않다. 예를 들어 세포 추출액의 Bradford 정량은 일반적으로 모든 단백질이 발색에 기여한 결과이며, 특정 효소의 양을 알고 싶다면 선택적 분석이 추가로 필요하다. 연구 질문을 “총단백질이 얼마인가?”와 “표적 단백질이 얼마인가?”로 분리해야 분석법을 올바르게 선택할 수 있다.

2. 280 nm 자외선 흡광도(A280)와 람베르트–베르 법칙

단백질의 트립토판(Trp)과 티로신(Tyr), 일부 이황화결합은 약 280 nm에서 자외선을 흡수한다. 아미노산 구성과 결합 상태에 따라 몰흡광계수 ε가 달라진다. 잘 정제된, 성분을 아는 단백질에서는 A280을 측정하여 농도를 추정할 수 있다. 하지만 혼합물에서는 단백질마다 ε가 다르고 핵산 등 다른 성분이 간섭할 수 있으므로 단일 흡광도만으로 정확한 총단백질 농도를 보장할 수 없다.

3. 발색 반응으로 총단백질 농도를 측정한다

Bradford 분석에서는 Coomassie Brilliant Blue 색소가 단백질에 결합할 때 흡광 특성이 바뀌는 현상을 이용한다. 일반적으로 595 nm 부근에서 신호를 읽는다. BCA 분석은 단백질이 알칼리성 환경에서 Cu²⁺를 Cu⁺로 환원시키는 반응과 BCA-Cu⁺ 착물의 발색을 이용하며 보통 562 nm에서 측정한다. 뷰렛 반응은 알칼리성 용액에서 구리 이온과 펩타이드 결합이 착물을 형성하는 현상을 이용한다. 서로 다른 분석법은 감도·간섭물질·단백질별 신호에 차이가 있다.

실제 호환성은 시약 제품과 사용한 완충액 조건에 따라 달라진다. 시료에 강한 환원제가 존재하면 BCA가 과대 발색할 수 있으며, 계면활성제는 Bradford 반응에 영향을 줄 수 있다. 표준액과 시료의 매질을 가능한 한 맞추고, 각 방법의 공백시험(blank) 및 권장 농도 범위를 준수해야 한다.

4. 표준곡선과 희석배수를 이용한 농도 계산

농도를 알고 있는 표준 단백질(BSA 등)로 여러 표준액을 만든 뒤 흡광도를 측정하면 검량선을 얻을 수 있다. 검량선이 유효한 선형 구간에서 미지 시료의 흡광도를 대입해 희석액 농도를 구하고, 마지막에 원액의 희석배수를 곱한다. 0 mg/mL 표준액도 색소 자체의 흡광도가 나타날 수 있으므로 반드시 공백값을 고려한다.

5. 특정 단백질은 항체나 특이적 활성을 이용해 검출한다

Western blot은 겔에서 단백질을 분리하고 막으로 옮긴 뒤 표적을 인식하는 항체로 검출하는 방법이다. 샌드위치 ELISA는 보통 고정화한 포획 항체와 표지된 검출 항체를 사용해 항원 신호를 얻는다. 표적 특이성이 충분히 검증되고 표준곡선이 마련되어 있으면 절대 농도에 가까운 정량도 가능하다. 그러나 항체의 교차반응·표준품 차이·검출기 포화 때문에 모든 Western blot과 ELISA가 자동으로 절대 정량법이 되는 것은 아니다.

표적이 효소라면 특정 기질에 대한 반응 속도도 기능성 지표가 된다. 다만 효소 활성은 온도·pH·저해제 등에 좌우되므로 효소 분자 개수와 일대일 대응하지 않을 수 있다. 표적 단백질의 물질량, 촉매 능력, 검출 신호는 서로 다른 측정 대상임을 구분한다.

6. 전기영동 밴드의 밀도와 반복 측정의 한계

겔 이미지에서 밴드별 적분 강도의 합에 대한 표적 밴드 강도의 비율을 구하면 겔 염색 반응을 이용한 대략적인 상대 순도 지표를 얻을 수 있다. 그러나 밴드가 겹치거나 염색 강도가 단백질마다 다를 수 있으므로 이 비율을 곧바로 정확한 단백질 질량비로 동일시하지 않는다. 정량 실험은 반복하여 평균과 산포를 보고하고 공백값 보정, 희석 오류, 피펫 사용 오차를 평가해야 한다.